增加骨密度功能动物试验评价方法

1试验项目：

动物试验：分为方案一（补钙为主的受试物）和方案二（骨代谢有关的其它功效成份，如以内分泌调节等作用为主的不含钙或不以补钙为主的受试物）两种。方案二仅适用于每日钙摄入量在100mg以下的受试物，其它受试物均采用方案一。

1.1 方案一：对幼鼠生产发育的影响

动物选择出生4周左右的断乳大鼠，约60-75g，同一性别，每组8-12只。经适应3-5天后，禁食16 小时，称体重，按体重随机分组，分笼饲养。动物以基础低钙饲料喂养，并自由饮水（去离子水，以避免从饮水中获得钙）。喂养时间为4周。，每周测量体重、身长一次，记录一周摄食量，计算食物利用率；实验末，取其中双侧股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重。右侧进行骨钙测定，左侧进行骨密度测定，取股骨或肱骨进行骨病理试验。

1.2 方案二：对去势诱导的骨质疏松模型大鼠的影响

实验动物选择Wistar或SD雌性大鼠，300g左右，实验前适应1周。麻醉，行去势手术，摘除双侧卵巢；另取部分大鼠行类似手术但不切除双侧卵巢，仅摘除部分脂肪。手术后大鼠经适应性饲养3-5天后分组，实验动物按体重随机分组，每组至少10只。每天给予受试样品1次。动物自由饮水和基础饲料。喂养时间为12周。试验末取大鼠双侧股骨测定。测定股骨干重、骨钙含量，骨密度测定， 骨组织病理学检查。

1.3钙吸收代谢实验：

出生4周左右的断乳SD大鼠，体重约60-80克，同一性别，每组至少6只。    大鼠经适应3-5天后，分笼饲养4周。每周测量身长、体重一次。用低钙对照组的基础低钙饲料（150mg/100g饲料）配制受试物各剂量组和碳酸钙对照组饲料。动物自由饮食，每周称量动物食物消耗量，计算食物利用率。动物自由饮用去离子水。实验进行到第四周前三天进行钙代谢实验，记录3天摄食量（g/3d），收集3天的粪便，测定饲料及粪便中钙含量。测定方法用原子吸收分光光度法进行测定。

摄入钙（mg/d）= 饲料中钙含量（mg/g）× 饲料消费量（g/d）

粪钙（mg/d）= 粪便中钙含量（mg/g）× 粪便排出量（g/d）

钙表观吸收率=（摄入钙 — 粪钙）/摄入钙*100%。

2 试验原则：

2.1 根据受试样品作用原理的不同，方案一和方案二任选其一进行动物试验。

2.2 所列指标均为必做项目。

2.3 样品使用未批准用于食品的含钙化合物，必须进行钙吸收代谢试验；样品使用属营养强化剂范围内的钙源及来自普通食品的钙源（如可食动物的骨、奶等），可以不进行钙吸收代谢试验。

3 结果判定

3.1 方案一：

a)    生长发育指标（体重、身长、股骨干重）中至少一项显著高于低钙对照组；

b)    股骨骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组，且病理学上（骨组织学结构或钙沉积）两方面结果中的任一方面优于低钙对照组；

c)    进行钙吸收试验时，钙吸收率显著高于低钙对照组，且高剂量组不低于相应钙含量的碳酸钙对照组。

    符合以上三项要求，可判定受试物具有“有助于增加骨密度功能”的作用。

3.2 方案二：

受试物试验组的股骨骨钙含量或骨密度显著高于模型对照组，且骨组织形态学指标较去势模型对照组有显著性改善，方可判定受试物具有“有助于增加骨密度功能”的作用。